色譜柱異常與解決方法
柱壓與硅膠基質(zhì)的形態(tài)(如無(wú)定形或球形硅膠)、顆粒大小、填料合成條件、裝柱條件、所用流動(dòng)相和分析時(shí)的溫度有關(guān)。
不同廠家的色譜柱柱壓會(huì)有所差別，相同流動(dòng)相和溫度的條件下，不同廠家的新色譜柱有的柱壓可能相差4、5個(gè)MPa，特別是低端和高性能色譜柱之間，這一區(qū)別比較明顯。這是由色譜柱廠家所選用的硅膠基質(zhì)及其生產(chǎn)條件決定的，這種差異的存在是正常的。
同時(shí)需要說(shuō)明的一點(diǎn)是，柱壓與柱效有一定的關(guān)系，通常柱效高的色譜柱柱壓相對(duì)而言會(huì)高一點(diǎn)，但柱壓高的色譜柱并不一定就具有高柱效。
在色譜柱的使用過(guò)程中柱壓通常會(huì)出現(xiàn)兩種升高的形式：
第一種是，隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)色譜柱柱壓慢慢上升，這是正常的;
第二種是，使用過(guò)程中(流動(dòng)相和溫度沒(méi)有改變的條件下)色譜柱壓力突然升高很多。這種壓力突然升高的現(xiàn)象，通常是由工作人員操作不當(dāng)引起的。
原因：
樣品太臟，使用前沒(méi)有過(guò)濾，導(dǎo)致柱篩板堵塞;
樣品含有的雜質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不是很好，與流動(dòng)相混合后析出，導(dǎo)致柱塞板堵塞;
使用緩沖鹽，處理錯(cuò)誤，緩沖鹽在色譜柱中析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙。
解決辦法對(duì)于第二種，即柱壓突然升高的情況，通常有以下幾種解決辦法：
將色譜柱反接，用含水比例較大的流動(dòng)相進(jìn)行沖洗。
色譜柱進(jìn)樣一端的篩板取下，分別放在水中和甲醇中超聲或更換新的柱篩板。如果柱效沒(méi)變，但柱壓仍然較高，則應(yīng)考慮進(jìn)樣端填料受污染的問(wèn)題，因此除了取下進(jìn)樣端篩板超聲外，還需要挖掉進(jìn)樣端的部分填料，挖去填料之前先檢查一下填料的顏色，如果填料的顏色發(fā)生了變化，則應(yīng)該挖掉直到見(jiàn)到白色的填料為止。
挖掉后色譜柱將出現(xiàn)一個(gè)缺口，填補(bǔ)缺口的填料可以從另一支相同品牌、相同型號(hào)的報(bào)廢色譜柱的出口端獲得，填料用有機(jī)溶劑如甲醇等調(diào)成糊狀裝入缺口處，壓緊刮平，再裝上篩板。
色譜柱使用經(jīng)驗(yàn)
色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。
但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
1. 樣品的前處理
a. 最好使用流動(dòng)相溶解樣品。
b. 使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c. 使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。
2. 流動(dòng)相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。
在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3. 流動(dòng)相流速的選擇
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。
對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意
由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。
對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。
含水流動(dòng)相最*在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好加入三氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。
使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
沖柱子的目的
只要是有機(jī)溶劑就行，不過(guò)黏度不要太大，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能夠防止細(xì)菌生長(zhǎng)，沖柱子的目的就是為了防止細(xì)菌生長(zhǎng)堵塞儀器系統(tǒng)和柱子。一般甲醇和乙腈相互沖洗是沒(méi)有問(wèn)題的，但乙腈要比甲醇價(jià)格貴的。
保留時(shí)間變化的原因
柱頭塌陷
在使用過(guò)程中，填料下沉，在柱子進(jìn)口處出現(xiàn)一個(gè)小空間，使得分離效果不良。
補(bǔ)救方法：卸開柱頭螺絲，找一點(diǎn)同類填料，用甲醇濕潤(rùn)后，添在柱子上，反復(fù)幾次。然后裝上螺絲，用溶劑沖洗1-2小時(shí)，使之平衡。
小結(jié)
正確使用緩沖鹽很有必要，既可以防止緩沖鹽析出，也可以達(dá)到提高色譜柱使用壽命的目的。我們不妨用一句話來(lái)總結(jié)它的使用方法：用前要過(guò)濾，用后需沖洗。
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