起源于上世紀(jì)60年代末的高效液相色譜(HPLC)技術(shù)，建立在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，開(kāi)始了高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測(cè)器各技術(shù)不斷進(jìn)步的旅程。解析真實(shí)世界的奧秘幾乎都要用到分離技術(shù);有機(jī)物構(gòu)成了物質(zhì)世界的絕大部分;而超過(guò)80%的有機(jī)物，大都采用HPLC進(jìn)行分離和分析。因此，液相色譜構(gòu)成了科學(xué)儀器領(lǐng)域極大的單品類(lèi)，其市場(chǎng)之大讓許多企業(yè)魂?duì)繅?mèng)縈，無(wú)數(shù)企業(yè)前赴后繼地進(jìn)入液相色譜市場(chǎng)。本文將簡(jiǎn)要回顧高效液相色譜商用技術(shù)的進(jìn)展，并在下篇簡(jiǎn)述近年來(lái)的新產(chǎn)品，希望對(duì)您下次入囊前有些許參考。
HPLC技術(shù)誕生和發(fā)展
1903年，植物學(xué)家Tswett在會(huì)議上報(bào)道了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法(后來(lái)文獻(xiàn)發(fā)表于1906年)，Tswett將這種方法命名為色譜(Chromatography)，管內(nèi)填充物被稱(chēng)之為固定相，沖洗劑被稱(chēng)之為流動(dòng)相。
1941年，Martin等采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動(dòng)相分離乙?；被?，Martin和Synge一同提出著名的色譜塔板理論，兩人獲得了1952年的Nobel獎(jiǎng)。色譜塔板理論提出：理論板與液體流速和顆粒直徑的平方成正比，理論板越薄越好。因此，最薄的理論板應(yīng)該通過(guò)使用非常小的顆粒和整個(gè)柱長(zhǎng)度上的巨大壓力差來(lái)獲得。[1]
液固色譜被創(chuàng)立后的50多年時(shí)間里，液固色譜裝置并無(wú)實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)，溶劑的流速依賴(lài)于重力，液相色譜系統(tǒng)效率低下。直到20世紀(jì)60年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，人們把氣相色譜中獲得的系統(tǒng)理論與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用于液相色譜研究。
1966年，耶魯大學(xué)的Horvath提出高效液相色譜(HPLC)的名稱(chēng)[2]，后于1967年開(kāi)發(fā)了第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了HPLC的時(shí)代。1972-1974年，6000 psi泵、10μm粒徑色譜柱和無(wú)隔墊進(jìn)樣器的引入，標(biāo)志著HPLC從“高壓”向“高效”的轉(zhuǎn)變。HPLC用細(xì)粒徑高效填充色譜柱，大大提髙了液相色譜的分離能力;采用高壓泵輸送流動(dòng)相替代重力作用，使柱效更高，并提高液相色譜的分析速度;液相色譜與光學(xué)檢測(cè)器相結(jié)合，也使HPLC不僅可以分離，還可以同時(shí)完成分析任務(wù)。HPLC本身就是一套分離分析系統(tǒng)。
1966年，Csaba Horváth和Seymour(Sandy)Lipsky發(fā)表了HPLC的第一篇文獻(xiàn)，即核苷酸和甲狀腺化合物的離子交換分離
1973年，第一屆HPLC會(huì)議在瑞士因特拉肯舉行，1982年后每年舉辦。
20世紀(jì)70年代末至80年代初，HPLC開(kāi)發(fā)了分離肽和蛋白質(zhì)的方法，為今日蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥分析奠定了基礎(chǔ)。
1979年至80年代初，開(kāi)發(fā)了用HPLC分離對(duì)映體的方法，最初采用在流動(dòng)相中加入修飾劑，后來(lái)開(kāi)發(fā)了可分離對(duì)映體的固定相。
20世紀(jì)80年代中后期，John Fenn開(kāi)發(fā)了ESI離子源，成功用于LC-MS。
2004年前后，引入< 2μm粒徑的新系統(tǒng)，推動(dòng)耐壓15,000-20,000 psi的UHPLC的出現(xiàn)。
你所不知道的商用HPLC發(fā)展史
色譜柱技術(shù)
色譜柱技術(shù)是儀器開(kāi)發(fā)的主要驅(qū)動(dòng)因素之一。1967年，耶魯大學(xué)的Csaba Horváth和同事們?cè)诒犹盍?現(xiàn)稱(chēng)為表面多孔填料，SPP)方面的工作代表了HPLC柱和儀器技術(shù)的突破。50微米的球形玻璃珠涂有一層薄薄的聚苯乙烯樹(shù)脂聚合物層(1-3μm)，衍生形成陰離子交換功能，并用于分離核苷酸。顆粒被裝入不銹鋼柱(內(nèi)徑1mm，長(zhǎng)度3米)，這會(huì)產(chǎn)生高背壓，需要使用泵將溶劑推過(guò)柱。這代表一個(gè)開(kāi)始的趨勢(shì)，即較小的顆粒會(huì)提高柱效，以提供更好的分離性能，同時(shí)也會(huì)增加柱背壓，使其與平均顆粒直徑成反比;因此，在接下來(lái)的幾年里，泵輸出壓力將成為一個(gè)重要因素。除此之外，流速、額外柱效應(yīng)(系統(tǒng)死體積)、峰寬減小、洗脫速度、樣品通量和檢測(cè)器能力等參數(shù)都成為改善HPLC系統(tǒng)所有部分的驅(qū)動(dòng)因素。
第一臺(tái)HPLC的誕生
有案例表明，Horvath及其同事的突破性工作是HPLC的開(kāi)始(當(dāng)時(shí)指的是高壓LC)。他們自制了梯度洗脫的系統(tǒng)，使用兩臺(tái) Milton Roy 微型泵。梯度由一個(gè)含有弱溶劑的攪拌儲(chǔ)液池開(kāi)始形成;然后由一個(gè)泵向該儲(chǔ)液池輸送受控但不斷增加的強(qiáng)溶劑量;第二臺(tái)高壓泵將越來(lái)越濃的溶劑混合物從儲(chǔ)液池推到色譜柱上;用一個(gè)帶有8μL流動(dòng)池的改良分光光度計(jì)檢測(cè)。
1967年，他們與當(dāng)?shù)豍icker Nuclear儀器公司合作，推出LCS-1000——第一臺(tái)真正的商用HPLC。該設(shè)計(jì)由工程師Emmett Watson牽頭，他離開(kāi)Waters成為一名顧問(wèn)。LCS-1000有一個(gè)高壓泵(高達(dá)4000 psi)、一個(gè)進(jìn)樣Loop閥、一個(gè)柱溫箱、裝有上述薄層填料的色譜柱，以及一個(gè)基于低壓汞蒸氣燈的固定波長(zhǎng)檢測(cè)器(254 nm)。該儀器不適用于Picker Nuclear的非色譜產(chǎn)品范圍，1968年，該技術(shù)被Varian 公司收購(gòu)(Varian后被安捷倫收購(gòu))。
1967年，Picker Nuclear公司推出第一臺(tái)商用HPLC：LCS-1000
1961年，陶氏化學(xué)公司的J.C. Moore請(qǐng)Waters公司開(kāi)發(fā)產(chǎn)品，用凝膠色譜柱分析聚合物。Waters獲得Moore許可證后，于1963年推出了第一臺(tái)凝膠滲透色譜儀GPC-100，采用500 psi的泵。
1963年，Waters公司推出第一臺(tái)凝膠滲透色譜儀GPC-100
1967年，Waters推出HPLC系統(tǒng)ALC-100(ALC是分析液相色譜儀的首字母縮寫(xiě))，它改進(jìn)了原有GPC-100系統(tǒng)，減少死體積，采用更高壓力的Milton Roy泵，流通紫外檢測(cè)器和(可選)和折射率(RI)檢測(cè)器。1968年P(guān)ittcon會(huì)議上，Waters推出ALC-100。Waters將其品牌口號(hào)“Ther Liquid Chromatography People“注冊(cè)成商標(biāo)，Waters公司成為了LC的代名詞。1972年，Waters的James Waters父子拜訪Robert B. Woodward 及其博士后Helmut Hamberger，分離維生素B-12合成過(guò)程中中間體的異構(gòu)體;從此HPLC打開(kāi)了有機(jī)合成的市場(chǎng)。
1967年，Waters公司推出第一臺(tái)HPLC系統(tǒng)ALC-100，1968年P(guān)ittcon展出
色譜學(xué)家傾向于將HPLC的起源推至更早期的1964年。杜邦公司的Jack Kirkland參觀Eidhoven理工大學(xué)。在一間實(shí)驗(yàn)室里，Josef F. K. Huber已在自制粗糙的HPLC儀器，帶有紫外檢測(cè)器，在GC顆粒上包裹液體(和流動(dòng)相不混溶)后填充了色譜柱。參觀后，Kirkland說(shuō)服杜邦公司的經(jīng)理讓他研制HPLC，進(jìn)行GC無(wú)法全部勝任的農(nóng)藥分離。
1969年，杜邦公司推出820型集成色譜儀
1969年，杜邦公司推出820型集成色譜儀，有一個(gè)恒壓泵、一個(gè)自制的UV 254 nm檢測(cè)器(410型)和杜邦的ZIPAX SPP色譜柱。杜邦推出了第一批化學(xué)鍵合相，改變了梯度HPLC的實(shí)踐;他們的ZORBAX column產(chǎn)品仍然存在，現(xiàn)在由安捷倫科技制造和銷(xiāo)售。(杜邦于1986年退出HPLC儀器市場(chǎng)，隨后IBM儀器公司短暫進(jìn)入該市場(chǎng)。)
日本的島津公司，1969年開(kāi)發(fā)GPC系統(tǒng)，1972年與杜邦簽訂許可合同后開(kāi)始制造銷(xiāo)售LC-1(LC-830)，1978年推出自主研制的LC-3A，以CDQR方式的單柱塞型送液?jiǎn)卧獮樘卣鳌?
1978年島津推出LC-3A
進(jìn)樣閥的演變
幸運(yùn)的是，當(dāng)杜邦和Waters[3]將新的SPP填料(37-50μm粒徑范圍)裝入標(biāo)準(zhǔn)柱(內(nèi)徑2.1 mm，長(zhǎng)度50或100 cm)時(shí)，背壓適中，因此第一臺(tái)商用液相色譜儀采用了在線GC隔墊進(jìn)樣器。隨著填料顆粒變小，隔墊進(jìn)樣器的耐壓能力不足，促使停流(stop-flow)技術(shù)的出現(xiàn)。這種手動(dòng)進(jìn)樣很麻煩，限制了樣品的通量，因此Valco的創(chuàng)始人Stan Stearns調(diào)整了GC閥，使進(jìn)樣壓力達(dá)到4500 psi。六通進(jìn)樣閥在生產(chǎn)率和重現(xiàn)性方面取得了真正的突破，并通過(guò)改變樣品Loop定量環(huán)尺寸，使進(jìn)樣體積更靈活，還促進(jìn)了后來(lái)進(jìn)樣器的自動(dòng)化。
1968年Valco推出6通進(jìn)樣閥
Waters在其集成LC系列中使用了六通進(jìn)樣閥后，1973年推出了自己的U6K進(jìn)樣器，可進(jìn)行方便、可變體積和可靠的進(jìn)樣，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。該進(jìn)樣器還具有一個(gè)創(chuàng)新的旁路通道，可在閥門(mén)循環(huán)時(shí)降低壓力沖擊，從而保護(hù)色譜柱在重復(fù)進(jìn)樣后不會(huì)損壞。在早期，色譜柱的穩(wěn)定性較差，但隨著色譜柱填充方法的改進(jìn)，問(wèn)題也就不那么嚴(yán)重了。
1973年Waters推出U6K進(jìn)樣器
后來(lái)，Rheodyne公司于1976年推出7125型進(jìn)樣閥，對(duì)Valco方法進(jìn)行了改進(jìn)，使進(jìn)樣器將樣品注射入閥的中心，可使用單個(gè)Loop環(huán)實(shí)現(xiàn)可變的進(jìn)樣量。
1976年Rheodyne公司推出7125型進(jìn)樣閥
模塊的崛起
早期的許多色譜用戶(hù)認(rèn)為，每個(gè)制造商各有優(yōu)勢(shì)，因而希望將泵與進(jìn)樣器、檢測(cè)器等結(jié)合起來(lái)，目的是構(gòu)建一個(gè)具有快速可互換(或可升級(jí))模塊的高級(jí)系統(tǒng)。為了滿足需求，一些制造商(尤其是OEM行業(yè)的制造商)決定開(kāi)發(fā)可以?xún)?yōu)化性能的獨(dú)立模塊。實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)控制公司(Laboratory Data Control，LDC)，該公司還利用Emmett Watson的服務(wù)構(gòu)建價(jià)格合理的獨(dú)立模塊，包括254 nm紫外檢測(cè)器。該檢測(cè)器成為多家色譜公司的主要OEM組件。規(guī)模更大的Milton Roy公司收購(gòu)了LDC，并成為許多HPLC公司和個(gè)人色譜儀的模塊供應(yīng)商。Valco和Rheodyne等零部件公司專(zhuān)門(mén)生產(chǎn)注射閥(進(jìn)樣閥)和切換閥。Schoefel、Cecil Instruments和Pye Unicam等檢測(cè)器公司開(kāi)發(fā)了專(zhuān)門(mén)的探測(cè)器。許多較小的公司開(kāi)發(fā)了其他外圍設(shè)備，可以根據(jù)需要快速更換。
1968年LDC/Milton Roy推出模塊化組件
液相泵的發(fā)展
Waters緊隨模塊潮流，開(kāi)發(fā)了一款名為M-6000的獨(dú)立泵，這是第一款專(zhuān)門(mén)為HPLC開(kāi)發(fā)的泵?；趩位钊O(shè)計(jì)的早期泵輸送脈動(dòng)流，因此需要脈沖阻尼系統(tǒng)，以降低流量敏感檢測(cè)器中的噪聲。然而，大量脈沖阻尼器延遲了梯度流動(dòng)相到達(dá)色譜柱，增加了分析時(shí)間。M-6000使用了兩個(gè)往復(fù)式活塞，以便更平穩(wěn)地流向色譜柱。其6000 psi的額定壓力足以滿足20世紀(jì)70年代初引進(jìn)的25 cm柱(內(nèi)徑4.6mm)中10微米粒徑填料的要求。
1972年Waters推出M-6000液相泵
Altex(后被貝克曼收購(gòu))開(kāi)發(fā)了全新概念的泵，使用可變活塞速度和快速再充滿(refill)，由此產(chǎn)生的110型泵的流量比當(dāng)時(shí)大多數(shù)低成本的往復(fù)式泵都要平穩(wěn)。
1976年Altex公司推出110泵
為了提供更高的壓力和非脈動(dòng)流量，瓦里安(后被安捷倫收購(gòu))、Isco和Nester-Faust(后被珀金埃爾默收購(gòu))選擇開(kāi)發(fā)注射泵。在這里，大容量(250毫升)活塞由精確的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)。這些泵基本上沒(méi)有脈沖，可以耐受高達(dá)6000 psi的高壓，后來(lái)達(dá)到8500 psi。對(duì)于二元梯度，需要兩個(gè)注射泵。但由于溶劑體積可壓縮性，色譜柱在梯度洗脫過(guò)程中遇到問(wèn)題;進(jìn)入混合器的每種溶劑的實(shí)際流量與控制器上的編程不同，這會(huì)產(chǎn)生成分錯(cuò)誤——尤其是當(dāng)每臺(tái)泵的啟動(dòng)體積不同時(shí)。注射器泵雖然新穎，但最終消失了。然而，注射泵值得一提，因?yàn)檫@項(xiàng)新技術(shù)試圖在提供無(wú)脈沖高壓流量時(shí)跳出框框思維。
1970年瓦里安推出4100/4200注射泵
你好，工業(yè)3.0
在20世紀(jì)60年代末和70年代初，主要的數(shù)據(jù)輸出靠條形圖記錄儀。對(duì)于定量，通常采用手動(dòng)方法，如切割和稱(chēng)重圖紙或使用機(jī)械求積儀。但Autolab改變了這一切，Autolab后來(lái)是SpectraPhysics(后被賽默飛收購(gòu)又賣(mài)出，現(xiàn)屬Newport)的一個(gè)部門(mén)，它推出了System IV計(jì)算積分器，提供數(shù)字讀數(shù)。輸出可以表示為簡(jiǎn)單的面積百分比或基于方法中存儲(chǔ)的校準(zhǔn)因子。由于其較大的動(dòng)態(tài)范圍，色譜儀不再需要在調(diào)整信號(hào)衰減的同時(shí)進(jìn)行多次進(jìn)樣，從而提高了實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)率。
1969年Autolab推出Autolab System IV計(jì)算積分器
由微處理器控制的惠普HP 3380A積分器更進(jìn)一步，它既是記錄器又是字母數(shù)字打印機(jī)繪圖儀，因此所有信息都在一張圖表紙上。此后，許多制造商推出了自己的數(shù)據(jù)系統(tǒng)來(lái)補(bǔ)充HPLC硬件。
1974年惠普推出HP 3380A數(shù)字積分器
1979年，Nelson Analytical開(kāi)發(fā)了基于個(gè)人電腦的數(shù)據(jù)分析軟件，利用新的大規(guī)模集成電路(LSI)構(gòu)建模數(shù)轉(zhuǎn)換器，并提供具有強(qiáng)大計(jì)算能力的儀器控制和數(shù)據(jù)采集。Nelson產(chǎn)品成為許多制造商系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)IBM PC推出時(shí)，Nelson對(duì)其軟件進(jìn)行了調(diào)整，使其能夠同時(shí)進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)處理，這一概念很快取代了后來(lái)液相色譜儀中的獨(dú)立積分器。
1979年Nelson Analytical推出用于液相色譜儀的PC軟件
在20世紀(jì)70年代中期，高效液相色譜法越來(lái)越多地被用于制藥和其它行業(yè)，用戶(hù)每天需要分析許多樣品。第一臺(tái)進(jìn)入市場(chǎng)的HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器來(lái)自Micromeritics公司，這是一家專(zhuān)門(mén)從事粒度測(cè)量的公司，他們于1974年推出708A型LC自動(dòng)進(jìn)樣器，使用旋轉(zhuǎn)托盤(pán)中的管狀小瓶。將一根針?lè)湃胄∑恐?，刺穿瓶蓋，同時(shí)一個(gè)套環(huán)將瓶蓋向下推入小瓶，將樣品送入進(jìn)樣環(huán)中。該系統(tǒng)可對(duì)小瓶中進(jìn)行1-3次取樣。到20世紀(jì)70年代末，大多數(shù)主要供應(yīng)商都推出了自己的自動(dòng)進(jìn)樣器。
1974年Micromeritics推出708AL型自動(dòng)進(jìn)樣器
集成液相系統(tǒng)的回歸
隨著HPLC被廣泛接受，儀器外圍設(shè)備的中央控制更有意義;模塊式LC概念正在失去支持，因?yàn)槟K之間無(wú)法相互通信。用戶(hù)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于分析含有多種成分的樣品，梯度洗脫是必須的，這是實(shí)現(xiàn)中央控制的另一個(gè)驅(qū)動(dòng)因素。一種設(shè)計(jì)是產(chǎn)生二元梯度的雙泵系統(tǒng)(兩個(gè)泵在高壓側(cè)垂直連接在一起，需要一個(gè)混合器)。
惠普的分析部門(mén)(現(xiàn)為安捷倫科技)改進(jìn)了兩年前收購(gòu)的Hupe-Busch系統(tǒng)。HP 1084是第一款微處理器控制的LC，具有流量控制功能，并配有自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器和外部熒光檢測(cè)器。1084的精確流量控制是很好的賣(mài)點(diǎn)，并具有高度可重復(fù)的保留時(shí)間。
1976年惠普推出惠普1084型液相色譜儀
由于兩個(gè)泵產(chǎn)生梯度系統(tǒng)的成本很高，瓦里安和Spectra Physics等開(kāi)發(fā)商開(kāi)發(fā)了早期的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品使用了低壓側(cè)帶有溶劑比例閥的單泵。因此，使用兩個(gè)或三個(gè)比例閥，可以生成二元或三元梯度，在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中提供更大的靈活性。低壓梯度最終成為許多公司的標(biāo)準(zhǔn)，后來(lái)還開(kāi)發(fā)了更強(qiáng)大的四元泵。1978年，瓦里安推出的LC-5000是第一款集成的高效液相色譜系統(tǒng)，它將低壓?jiǎn)伪锰荻裙δ?、關(guān)鍵功能的微處理器控制、用于設(shè)置方法的鍵盤(pán)和CRT顯示器集成在一個(gè)單元中。主動(dòng)式進(jìn)樣止回閥解決了止回閥粘性和注入損失的問(wèn)題。1979年Spectra Physical推出的 Model 8000采用的設(shè)計(jì)與當(dāng)今儀器中使用的溶劑混合設(shè)計(jì)幾乎相同。
瓦里安LC-5000液相色譜儀
1975年，Dionex(后被賽默飛收購(gòu))作為Durrum Instruments的一個(gè)部門(mén)成立，以應(yīng)對(duì)一個(gè)新興的色譜市場(chǎng)：離子色譜(IC)。Dionex很快成為分離無(wú)機(jī)和有機(jī)離子化合物的被認(rèn)可品牌。他們產(chǎn)品由陶氏化學(xué)公司授權(quán)，包括：使用離子抑制器從流動(dòng)相中去除鹽，對(duì)分離的離子進(jìn)行電導(dǎo)檢測(cè)。Dionex還開(kāi)發(fā)了專(zhuān)門(mén)的IC柱，用于嚴(yán)格分離如飲用水中的痕量溴酸鹽和鹵代氧化物，使用脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行碳水化合物分離，以及離子排斥分離。
1975年Dionex推出Model 10離子色譜儀
多種色譜檢測(cè)器
HPLC的前些年，光譜檢測(cè)器占主導(dǎo)地位，停流掃描分光光度檢測(cè)器在市場(chǎng)上幾乎不被接受。采用DAD光電二極管陣列檢測(cè)器后，可進(jìn)行實(shí)時(shí)光譜測(cè)量，并可以實(shí)時(shí)獲得完整的紫外-可見(jiàn)光譜，后來(lái)成為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1977年，惠普推出了第一個(gè)DAD檢測(cè)器8450，為此后的DAD檢測(cè)器設(shè)定了黃金標(biāo)準(zhǔn)。
1977年惠普推出8450 DAD檢測(cè)器
隨著GC-MS的巨大成功，各種液相色譜的接口類(lèi)型被開(kāi)發(fā)出來(lái)，以結(jié)合兩種顯然不兼容的技術(shù)——一種在液體環(huán)境中，另一種在真空中。接口技術(shù)包括直接液體接口、傳輸設(shè)備、粒子束、連續(xù)流FAB、離子噴霧和熱噴霧。
第一個(gè)獲得市場(chǎng)成功的是傳送帶接口，它借鑒了R.P.W.Scott[4]和Victor Pretorius[5]的早期工作，他們使用移動(dòng)的電線將部分LC柱流出物輸送至火焰離子化檢測(cè)器(由英國(guó)Pye Unicam公司銷(xiāo)售)。第一個(gè)成功的LC-MS接口使用的不是移動(dòng)的金屬絲，而是移動(dòng)的傳送帶，可以傳輸更多的樣本，以獲得更好的靈敏度。在進(jìn)入真空區(qū)之前，溶劑被加熱蒸發(fā)。1976年，F(xiàn)innigan MAT(后被賽默飛收購(gòu))推出傳送帶接口[6]，優(yōu)點(diǎn)是：該接口具有良好的EI光譜和良好的靈敏度;但缺點(diǎn)是：難以使用非揮發(fā)性不穩(wěn)定分析物和LC緩沖液，以及性能不可靠。
1976年Finnigan MAT推出傳送帶式LC-MS接口
熱噴霧是一個(gè)更可靠的軟電離接口，它將色譜柱流出物通過(guò)一根非常細(xì)的加熱柱，產(chǎn)生細(xì)液滴噴霧，液滴在大氣壓(API)下通過(guò)低電流放電電極電離，形成溶劑離子等離子體。有時(shí)會(huì)觀察到EI型碎片，但質(zhì)子化或去質(zhì)子化的分子會(huì)出現(xiàn)明顯的碎片;非揮發(fā)性分析物的靈敏度較低。1987年，Marvin Vestel[7]創(chuàng)辦Vestec公司推出熱噴霧接口。熱噴霧是20世紀(jì)90年代之前使用最多的LC-MS接口。
1987年Vestec推出熱噴霧LC-MS接口
諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、耶魯大學(xué)的約翰·芬恩(John Fenn)開(kāi)發(fā)了ESI電噴霧[8]，可產(chǎn)生完整、高分子量、多重質(zhì)子化或去質(zhì)子化的離子。Jack Henion及其同事[9]開(kāi)發(fā)了一種離子噴霧接口，使用霧化氮?dú)廨o助電噴霧操作;SCIEX(隸屬于丹納赫)使用了Henion發(fā)明[10]，1989年推出第一款ESI類(lèi)型的LC-MS接口。ESI現(xiàn)在是標(biāo)準(zhǔn)的LC-MS接口。
1989年SCIEX推出ESI類(lèi)型的LC-MS接口
HPLC還發(fā)展了其它通用探測(cè)器。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)和帶電氣溶膠檢測(cè)器(CAD)均將LC流動(dòng)相流出物霧化成液滴，蒸發(fā)后留下非揮發(fā)性分析物的小顆粒?？偟膩?lái)說(shuō)，2005年ESA Biosciences(先被Dionex收購(gòu)，現(xiàn)隸屬于賽默飛)推出的CAD檢測(cè)器比ELSD更靈敏，并更利于梯度。CAD還可以檢測(cè)所有非揮發(fā)性和許多半揮發(fā)性分析物，且響應(yīng)一致。
2005年ESA Biosciences推出CAD檢測(cè)器
超高效時(shí)代
20世紀(jì)80-90年代的大部分時(shí)間里，液相色譜儀大都使用3-3.5μm或5μm顆粒、6000 psi泵和4.6 mm內(nèi)徑的色譜柱。為了滿足快速分析的需要，研究者開(kāi)發(fā)了亞2μm尺寸的填料，系統(tǒng)再次被推向更高的工作壓力;而且由此產(chǎn)生的粘性加熱效應(yīng)需要更窄內(nèi)徑的色譜柱，因此還需要顯著減少額外的色譜柱體積。2004年，Waters推出Acquity UPLC系統(tǒng)，滿足了21世紀(jì)初新的小顆粒短柱(5-15 cm)和更窄孔徑(內(nèi)徑2.0–2.1mm)的需求。Acquity對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)品/技術(shù)進(jìn)行了深思熟慮的組合，從而形成了一個(gè)具有合理低額外柱體積的實(shí)用系統(tǒng)。這項(xiàng)創(chuàng)新激勵(lì)其它十幾家公司推出類(lèi)似的UHPLC產(chǎn)品。
2004年Waters推出Acquity UPLC系統(tǒng)
其它創(chuàng)新
氣泡讓早期HPLC用戶(hù)很煩惱，流動(dòng)相中的氣泡會(huì)損害主泵，檢測(cè)器的流動(dòng)池中也會(huì)有氣泡。溶劑需脫氣，首先將溶劑煮沸，再通過(guò)精心設(shè)計(jì)的儲(chǔ)層將氣體擋在外面。后來(lái)SpectraPhysics發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)液罐中的氦噴射阻止了空氣在溶劑中的溶解，并允許低壓混合有效地用于HPLC泵。后來(lái)，膜脫氣器取代了氦氣噴射，成為今天所有HPLC/UHPLC的一部分。
Fittings(色譜接頭)也令人頭疼。通常情況下，過(guò)度擰緊配件會(huì)導(dǎo)致潛在泄漏，并在重新連接時(shí)表現(xiàn)不佳;來(lái)自不同公司的Fittings不兼容會(huì)產(chǎn)生死體積。Upchurch Scientific發(fā)明了手緊型接頭(Fingertight fittings)，易于重復(fù)使用，并耐受非常高的壓力。
創(chuàng)新技術(shù)排名
革命性技術(shù)
Analytical Scientist曾評(píng)出HPLC改變游戲規(guī)則的技術(shù)，分別是：
1. 第一臺(tái)商用HPLC系統(tǒng)LCS-1000，1967年由Picker Nuclear推出。
2. 6通進(jìn)樣閥，1968年由Valco推出。
它取消了隔墊進(jìn)樣器和停流技術(shù)，采用高壓進(jìn)樣，改善了保留時(shí)間、重現(xiàn)性、自動(dòng)化和定量性能。
3. 模塊化組件，1968年由LDC/Milton Roy推出。
獨(dú)立的254紫外檢測(cè)器、LDC RI檢測(cè)器和Milton Roy微型泵等組件迅速應(yīng)用于模塊化色譜儀。第一批儀器是集成的，所有內(nèi)部部件都在一個(gè)盒子里。模塊化市場(chǎng)的興起使研究人員能夠獲得最佳組件(例如，泵、進(jìn)樣器、柱架/柱溫箱、檢測(cè)器)。LDC是提供價(jià)格合理且功能強(qiáng)大模塊的組件公司。
4. Autolab System IV計(jì)算積分器，1969年由Autolab推出。
第一臺(tái)色譜自動(dòng)積分器用內(nèi)置的機(jī)械集成取代了切割稱(chēng)重、求積儀和記錄儀。該數(shù)據(jù)系統(tǒng)用于GC，并適用于LC。功能包括切線峰檢測(cè)、基線校正和峰面積歸一化，并允許使用響應(yīng)因子和內(nèi)標(biāo)。Autolab于1969年被SpectraPhysics收購(gòu)。
4. M-6000液相泵，1972年由Waters推出(與積分器排名并列)。
第一臺(tái)專(zhuān)為HPLC設(shè)計(jì)的泵，主要特點(diǎn)：雙往復(fù)式，不需要脈沖阻尼器，耐壓6000 psi，和一個(gè)低容量室。
5. 708AL型自動(dòng)進(jìn)樣器，1974年由Micromeritics推出。
第一臺(tái)高效液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器，提高了樣品通量和定量能力。后來(lái)的產(chǎn)品在該單元上進(jìn)行了改進(jìn)。
6. 惠普1084型集成型HPLC，1976年由惠普公司推出。
具有自動(dòng)進(jìn)樣、流量控制、紫外檢測(cè)器控制、記錄和報(bào)告功能;是第一臺(tái)帶有數(shù)字處理器控制的液相色譜儀，帶有內(nèi)置鍵盤(pán)和按鈕控制。多年來(lái)，它成為質(zhì)量和性能的黃金標(biāo)準(zhǔn)。
7. 8450型二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，1977年由惠普公司推出。
色譜過(guò)程中進(jìn)行動(dòng)態(tài)紫外-可見(jiàn)光譜分析時(shí)，DAD具有優(yōu)異的信噪比性能;與停流光譜掃描相比，生產(chǎn)率提高。其他公司很快也推出了自己的DAD檢測(cè)器。
8. 傳送帶式LC-MS接口，1976年由Finnigan MAT推出。
Finnigan MAT(被賽默飛收購(gòu))的McFadden、Schwartz和Bradford研制了傳送帶式接口(moving-belt interface);盡管有一些缺點(diǎn)，但傳送帶接口是真正的色譜接口，是市場(chǎng)上第一個(gè)成功的LC-MS接口，是許多方法中優(yōu)選的，直到電噴霧(ESI)出現(xiàn)。
9. 帶電氣溶膠探測(cè)器(CAD)，2005年由ESA Bioscience推出
CAD有時(shí)被稱(chēng)為“窮人的質(zhì)譜儀”，是一種通用檢測(cè)器。它的靈敏度比RI檢測(cè)器(也是一種通用探測(cè)器)高得多，至今仍在廣泛使用。
10. Acquity UPLC，2004年由Waters推出
為了引入亞2微米顆粒，需要新的高壓儀器。Waters Acquity UPLC系統(tǒng)是第一個(gè)設(shè)計(jì)用于滿足壓力輸出為12,000 psi的新型小顆粒色譜柱需求的系統(tǒng)。除此之外，Acquity還具有更低的額外柱效應(yīng)和其它改進(jìn)。
雖未上榜，但也極其創(chuàng)新的技術(shù)
除了被評(píng)選出的改變游戲規(guī)則的技術(shù)，還有以下里程碑，分別是：
1967年，Waters推出ALC-100
1969年，杜邦推出820型集成系統(tǒng)
1973年，Waters專(zhuān)為HPLC研制推出U6K進(jìn)樣器，旁通的Loop防止柱沖擊，耐壓6000 psi，可變進(jìn)樣體積。
1976年，Rheodyne 推出7125閥，進(jìn)樣針可注射到閥中心，該技術(shù)后非常流行，并OEM給許多儀器公司。
1972年，Cecil儀器公司推出CE212，第一款獨(dú)立的可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，帶停流掃描。
CE212 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器
1970年，瓦里安推出4100/4200注射泵，采用新的輸液泵原理，是第一個(gè)用于高壓操作和無(wú)脈沖流動(dòng)的注射泵，此后成功用于8500型HPLC。等度泵(4100型)的流速穩(wěn)定，而梯度泵(4200型)的溶劑體積可壓縮性，影響了流量和溶劑組成的重現(xiàn)性。
1976年，Altex推出110泵，是價(jià)格合理的獨(dú)立往復(fù)泵，通過(guò)可變活塞速度優(yōu)化占空比，降低流量脈動(dòng)。110提供了更流暢的液流、改善的基線和定量性能，并為未來(lái)的泵開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
1974年，惠普推出HP 3380A數(shù)字積分器，是微處理器控制的積分器，帶有圖表記錄器和字母數(shù)字打印機(jī)繪圖儀，一張紙上給出所有計(jì)算數(shù)據(jù)。
1979年，Nelson Analytical推出用于液相色譜儀的PC軟件。
將PC用作峰值積分、定量和儀器控制的驅(qū)動(dòng)程序，并OEM給許多制造商。在Nelson SW之后，幾乎所有儀器都使用PC來(lái)控制硬件和處理數(shù)據(jù);獨(dú)立計(jì)算集成商迅速死亡(該公司于1989年被PerkinElmer收購(gòu))。
1977年，瓦里安推出LC 5000液相色譜儀。
LC 5000采用一種全新的集成系統(tǒng)方法。該泵設(shè)計(jì)用于在一個(gè)泵頭中低壓混合三種溶劑，系統(tǒng)有自己的CRT顯示器和鍵盤(pán)，可以并排安裝檢測(cè)器，除數(shù)據(jù)系統(tǒng)(外部)外，LC的各個(gè)方面都由微處理器處理。LC 5000為后來(lái)大多數(shù)液相色譜儀提供了遵循的平臺(tái)。
1975年，戴安Dionex推出Model 10離子色譜儀。
Durrum instruments從陶氏化學(xué)獲得了授權(quán)，并成立了一個(gè)單獨(dú)的部門(mén)(Dionex)開(kāi)發(fā)一種產(chǎn)品，通過(guò)使用抑制柱的電導(dǎo)檢測(cè)來(lái)分離離子化合物，以去除流動(dòng)相中的鹽并降低背景電導(dǎo)率。Dionex成為了這項(xiàng)技術(shù)的被認(rèn)可品牌，至今仍保持第一(后被賽默飛收購(gòu))。
1987年，Vestec公司推出熱噴霧LC-MS接口。
EI型碎裂有時(shí)被認(rèn)為是質(zhì)子化或去質(zhì)子化分子的顯著碎裂。在有限的LC條件范圍內(nèi)，非揮發(fā)性分析物的靈敏度較低。直到20世紀(jì)90年代，熱噴霧成為主要的LC/MS接口，主要是由于其觀察到EI型碎裂。
1989年，SCIEX推出電噴霧(離子噴霧)LC-MS接口。耶魯大學(xué)的John Fenn開(kāi)發(fā)了電噴霧(ESI)源，可產(chǎn)生完整、高分子量、多重質(zhì)子化或去質(zhì)子化的離子，他因此獲得2002年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)，其獲獎(jiǎng)演講題為《當(dāng)大象飛翔》。Fenn觀察到ESI靈敏度與分析物濃度有關(guān)，毛細(xì)管柱的洗脫峰明顯比大口徑柱的洗脫峰更尖銳，從而在較低的進(jìn)樣量下大大提高了靈敏度?，F(xiàn)在，ESI是標(biāo)準(zhǔn)LC-MS接口。Henion等人開(kāi)發(fā)了離子噴霧接口，使用霧化氮?dú)廨o助電噴霧操作;SCIEX使用了Henion授權(quán)，是第一個(gè)銷(xiāo)售該產(chǎn)品的公司。
展望未來(lái)的50年
未來(lái)HPLC發(fā)展的幾大趨勢(shì)。
小型化
短期內(nèi)希望出現(xiàn)小型化、易于更換的單片或立柱集成到手持式或口袋大小的電池供電LC系統(tǒng)中，無(wú)需端部接頭(fitting)，不增加死體積。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，將出現(xiàn)小型化的個(gè)人分離系統(tǒng)，集成組件和靈敏、選擇性的通用檢測(cè)，能夠?qū)崟r(shí)分析個(gè)人的健康狀況。
LC與腕表配置的離子遷移譜儀耦合，腕表周長(zhǎng)提供漂移管的尺寸。應(yīng)用包括：健康檢查或銷(xiāo)售網(wǎng)點(diǎn)的新鮮度指標(biāo)和鑒別。
智能化
智能、自動(dòng)化儀器，只需一個(gè)按鈕就可執(zhí)行分析;非專(zhuān)業(yè)用戶(hù)無(wú)需更換色譜柱、開(kāi)發(fā)方法或進(jìn)行定量分析。就像自動(dòng)駕駛汽車(chē)一樣，將人工智能結(jié)合于液相色譜中。
專(zhuān)用化
集成樣品制備的專(zhuān)用分析儀，樣品可以放置在卡片或手指上，插入儀器，在不到1分鐘內(nèi)完成完整的分析(例如藥物篩選)。此外，廉價(jià)的連續(xù)/定期監(jiān)測(cè)LC設(shè)備，能夠在故障發(fā)生之前預(yù)測(cè)故障。
多維液相
希望短期內(nèi)出現(xiàn)實(shí)用的多維液相色譜系統(tǒng)，解決目前的定量問(wèn)題。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，智能、自動(dòng)儀器不需要非熟練用戶(hù)更換色譜柱、開(kāi)發(fā)方法或進(jìn)行定量分析。
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