51、通常我們在分析天然藥物成分的時候結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無法考察組分的PKa值，哪我們?nèi)绾稳ミx擇合適的流動相或者是拖尾該怎么改善呢？

答：如果天然產(chǎn)物中沒有易電離的極性基團，就不需要用緩沖鹽調(diào)節(jié)pH。如果天然產(chǎn)物中既有酸性基團，也有堿性基團，譬如有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的兩性物質(zhì)，建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4（如果是諸如月旭的Ultimate LP-C18這樣的耐酸色譜柱，還可以調(diào)得更低）。

如果pH控制在6.2-9.0之間，兩個基團都處于離子態(tài)，保留能力差，是不可取的。如果不清楚復(fù)雜物質(zhì)中含有什么基團，也請將pH調(diào)到2.4或更低。因為pH調(diào)低，起碼抑制了酸性基團的電離而處于中性分子狀態(tài)，而增加酸性基團這個部分在反相色譜中的保留能力；另外低pH還抑制了硅醇基的活性，有利于獲取對稱的峰形。

情況不明時候，為什么不建議調(diào)高pH呢？一方面一般色譜柱都不能承受pH9以上的條件；即使是像月旭的Xtimate系列一樣能耐12.5的柱子，調(diào)高pH和調(diào)低pH相比，還有一個硅醇基活性大的劣勢。

52、記得以前拿到C18柱，會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，這樣做的目的是什么呢？是先用溶劑活化嗎？然后再用樣品？還有測定短肽總是沖出來，該怎么解決呢？就是和溶劑峰出在一起，或者出在溶劑峰之前。

?答：C18柱，會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，因為色譜柱到達(dá)用戶手中時，時間長短不一，在存儲和運輸?shù)倪^程中，可能存儲液有些揮發(fā)，低流速的甲醇可以很好的浸潤固定相，使鍵合相很好的伸展，用溶劑平衡好系統(tǒng)后，可以采取多次進(jìn)樣或者加大進(jìn)樣量的方式以更快的獲得重現(xiàn)的色譜圖，這樣用樣品將色譜柱中的活化點飽和，就不會出現(xiàn)異常色譜現(xiàn)象的情況。

53、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中，會對柱子有什么損壞嗎？ph在2左右。

答：pH2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失，包括C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽，如果不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動相中，也不必過份擔(dān)心，多相當(dāng)于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧；有緩沖鹽就麻煩一點，保存期間水分揮發(fā)可能會導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶在柱內(nèi)析出，對柱子損傷很大。

54、色譜柱的安裝有什么技巧嗎？只要保證不漏就行了嗎？還有所謂的死體積怎么測定呢？

答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是完全不保留的物質(zhì)出峰時從進(jìn)樣到流過色譜柱的總體積，一般用極性非常強的尿嘧啶的出峰來測定。死體積包括柱體積（色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積）和柱外體積兩部分。

你從廠商這里買到色譜柱，柱體積已經(jīng)是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進(jìn)樣器內(nèi)死體積、毛細(xì)管長度、毛細(xì)管和色譜柱連接緊湊與否，保護(hù)柱或在線濾器產(chǎn)生的死體積大小，都對這個有影響。樣品在柱內(nèi)，除擴散外，還有和填料作用引起的組分分離；但樣品在柱外，那就只有擴散這個使柱效下降的因素了。所以，要取得好的分離效率，柱外體積應(yīng)該是越小越好。

峰有時候前延，有時候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動相組成（包括添加劑）、流動相pH以及柱溫，都對峰形有影響。另外測定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會不正常。所以好把你具體的測定條件也列一下，也便于有針對性的分析原因。

55、測定多肽樣品時，十幾肽或者二十幾肽時，有時峰前延的比較厲害，有時峰拖尾比較厲害，這是什么原因呢？是樣品的問題還是柱子的問題？

答：峰有時候前延，有時候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動相組成（包括添加劑）、流動相pH以及柱溫，都對峰形有影響。另外測定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會不正常。所以好把你具體的測定條件也列一下，也便于有針對性的分析原因。

56、柱子的平衡時間跟填料關(guān)系大嗎？哪種快，哪種慢？因為我在做離子交換柱的時候平衡是相當(dāng)?shù)穆?

答：根據(jù)色譜速率理論，粒徑越小，柱效越高，而且當(dāng)粒徑小到亞2微米左右時，線速度的提高，其分離度就不再降低，從而改變了許久以來人們不得不在 “速度和分離度之間取舍”的局面。

57、關(guān)于配置流動相，有機相我們可以甲醇乙腈同時用，這個是基于什么考慮的？是不是根據(jù)甲醇乙腈選擇性不同、樣品在這個兩者的溶解度的差異以及調(diào)節(jié)洗流動相脫能力來考慮的？

答：甲醇和乙腈同時用，可以獲得單純的甲醇或者乙腈不一樣的選擇性，而且洗脫能力也會改變，根據(jù)多元流動相的強度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb純?nèi)軇゛和b的溶劑強度因素；ψa、ψb分別為a和b的體積分?jǐn)?shù)，所以在藥典中有很多體系都使用甲醇乙腈體系；

58、三乙胺磷酸鹽緩沖液作流動相，柱壓一天比一天高，該怎么樣解決？

答：把柱子再生下，再生的方法搜一下有很多反沖對絕大部分色譜柱都是可行的,效果不錯。

59、新出廠液相色譜柱，保護(hù)溶劑一般是什么？怎樣進(jìn)行平衡清洗比較好，一般要平衡多長時間比較好？

答：柱子類型不同，保存溶劑也會不一樣吧，具體要看說明書的說明。對于反相柱，一般用甲醇（乙腈）保存，也有用80%左右甲醇濃度的甲醇/水保存的。一般用流動相平衡沖洗10-20個柱體積即可（注意：柱體積不等于空柱管體積，4.6x250mm的色譜柱空柱管體積是4.15ml，而柱體積只有約2.5ml）。

60、據(jù)說液相色譜柱柱壓達(dá)到一定高度就不能使用了，請問一般達(dá)到多高，用甲醇和乙腈是不是不一樣？

答：柱壓不是色譜柱不能使用的唯一因素，分離度才是重要的。柱壓只要沒高到儀器不能承受的地步，例如超過300bar，就可以一直使用。甲醇的粘度比乙腈高，同樣狀況的柱子，如果用甲醇做流動相，柱壓可能超了，換用乙腈會使柱壓下降不少，儀器還能承受。不過盡管柱壓還沒上升到接近400Bar的限定，如果發(fā)現(xiàn)柱壓上升速度較快，也需要及早對柱子進(jìn)行清洗維護(hù)，從根本上排除導(dǎo)致柱壓上升的源頭。

61、柱塞板可不可拆下用超聲波清洗，會有什么不良后果？

答：不建議將柱篩板拆下清洗，因為拆下承壓的柱篩板會導(dǎo)致柱床發(fā)生變化，影響色譜性能。應(yīng)該對污染的色譜柱行清洗維護(hù)，維護(hù)沒有效果，再把拆洗柱篩板作為后的手段。

62、一般正常使用一個C18柱能用多長時間？

答：柱壽命一般不按時間計算，按持續(xù)進(jìn)樣針數(shù)比較科學(xué)。一般正常使用維護(hù)，不超過pH和溫度等范圍，C18柱能達(dá)到500-2000針進(jìn)樣的壽命，視樣品干凈程度的不同而不同。