1. 流動相的準備。按照分析方法配制或準備流動相，用0.45μm微孔濾膜過濾后，超聲脫氣5分鐘。將流動相放置在液相色譜溶劑盤中, 將A、B、C泵吸液管分別放入甲醇、超純水和緩沖鹽溶劑瓶底部。
2. 開機。在儀器背面從上到下依次打開泵、進樣器、柱溫箱和檢測器單元的電源開關，打開電腦，等待約1～2分鐘，變色龍服務管理器將會自動啟動(或雙擊電腦右下角的變色龍軟件的服務管理器，點擊“啟動儀器控制器”激活服務管理器)。雙擊電腦桌面的“Chromeleon 7”圖標，進入變色龍軟件。
3. 管路排氣。向上掀開最上層泵單元前面板，擰松金黃色快速清洗閥(逆時針兩圈左右)，在軟件中設置A通道比例為100%(其他通道比例設置為0), 然后點擊“沖洗”，泵將以3.0mL/min的速度自動快速沖洗泵管內(nèi)殘留的氣體，2min后將自動停止，觀察流動相應連續(xù)、無氣泡。同樣設置需要使用的B、C泵通道比例為100%進行管路沖洗排氣，沖洗結束停泵后，關閉(擰緊)清洗閥。
4. 運行儀器。點擊"Pump module"，設置流速1.0mL/min，設置流動相A:C=40:60(設置C通道為60%)，點擊“馬達”啟動泵。點擊“UV”，設置波長230nm，點擊“氘燈”打開光源。
5. 創(chuàng)建方法。在“創(chuàng)建”菜單中點擊“儀器方法”，設定運行時間5min，在“診斷通道”項下點擊“取消選擇所有通道”，點擊下一步。pump常規(guī)設置按默認值，點擊下一步。在pump流速梯度窗口，點擊“刪除平衡階段”，設置流速為1.0mL/min，流動相A:C=40:60，點擊下一步。Sampler常規(guī)設置按默認值，點擊下一步，進樣模式按默認值，點擊下一步。在溫度控制窗口，不設直接點擊下一步。在UV通道窗口，設置1通道波長為230nm即可，點擊下一步直至完成。點擊左上角“保存”，將方法保存在Chromeleon 7下班級名稱文件夾中，以組號及測定物質(zhì)名稱命名。
6. 創(chuàng)建處理方法。在“創(chuàng)建”菜單中點擊“處理方法”，選擇基本定量，點擊下一步，輸入方法名稱并保存至班級文件夾下，點擊完成。
7. 創(chuàng)建序列。在“創(chuàng)建”菜單中點擊“序列”，在進樣名稱的格式欄中輸入樣品名稱(苯甲酸標準或果汁樣品)，樣品數(shù)設2，進樣次數(shù)設1，開始位置RA1，進樣量設20uL，點擊下一步。點擊瀏覽，選擇前面所建立的儀器方法和處理方法，用作新建樣品序列的分析。點擊下一步，輸入序列名稱并保存至班級文件夾下，點擊完成。
8. 測定。在自動進樣器紅色樣品盤中的RA1和RA2位置分別放入標準和樣品溶液瓶。在左側導航區(qū)下方點擊儀器，點擊工具欄的“監(jiān)視基線”，在彈出的“選擇監(jiān)視通道”窗口勾選所需的監(jiān)視波長和通道，待基線平穩(wěn)后，點擊“自動校零”，點擊工具欄的“停止”，停止基線采集。在左側導航區(qū)下方點擊數(shù)據(jù)(或選中新創(chuàng)建的序列)，按照實際放入樣品盤的待測溶液修改樣品名稱和類型(1號為標準，2號為樣品)，點擊“開始”，系統(tǒng)自動按順序進樣分析。如需添加樣品，可點擊“單擊這里可添加新的進樣”。
9. 記錄數(shù)據(jù)。在左側導航區(qū)下方點擊數(shù)據(jù)，打開剛運行的序列，雙擊序列數(shù)據(jù)表格第一列UV下方對應的色譜圖，記錄目標峰的保留時間和峰面積，如自動積分不正確，可利用手動積分刪除峰，再進行手動積分處理。
10. 關機。分析結束后，關紫外燈。如流動相中含有緩沖鹽，則設置流動相甲醇:水=5:95，沖洗色譜柱30min，然后用100%甲醇沖洗30min。停泵，關閉軟件，從下到上依次關閉各單元電源，關閉計算機，填寫儀器使用記錄。
高效液相色譜儀的日常維護保養(yǎng)
1. 保持貯液瓶清潔，對專用貯液瓶應定期清洗;用試劑瓶作貯液瓶時，要經(jīng)常更換。定期(如半個月)在稀硝酸溶液中超聲、清洗過濾器，保持過濾器暢通無阻。
2. 使用HPLC試劑和新蒸二次蒸餾水作流動相，所使用的溶劑其截止波長一定要低于檢測波長，對不是HPLC級的試劑要進行過濾(HPLC試劑出廠前已用0.02μm濾膜過濾)。對流動相一定要脫氣。
3. 流動相使用不要超過兩天，尤其是夏天，最好每天新鮮配制以免微生物的生長。腐蝕性溶劑或緩沖液在泵內(nèi)存放不可過夜，否則溶劑會對泵起腐蝕作用。使用腐蝕性物質(zhì)后要沖洗，先用水后用甲醇。
4. 每天開始使用儀器，注意放空排氣，確保泵頭、流動池以及其它流路系統(tǒng)中無氣泡存在。
5. 珍惜保護色譜柱，避免柱頭突然產(chǎn)生大的波動，擾動損傷柱床。如避免泵啟動過速、升壓過快、樣品閥搬動過慢所造成的柱壓大的波動。
6. 采用保護(警戒)柱，延長柱壽命。如污染物堆積于保護柱柱頭，造成柱壓升高，柱效下降，峰形變差時，卸下用強溶劑反沖后再用或更換新保護柱。
7. 避免超負荷進樣，對250×4.6mm的柱子,絕對進樣量應不超過100μg。在靈敏度允許的前提下，應盡量將試樣濃度降低，減少絕對進樣量(進樣體積可保持不變)，這是保持HPLC柱性能持久良好的重要舉措之一。
8. 經(jīng)常用強溶劑沖洗柱子，將柱內(nèi)強保留組分及時洗脫出。反相柱用異丙醇--二氯甲烷(1：1)沖洗，正相(硅膠柱)用純甲醇或異丙醇沖洗，時間均不少于1h。
9. 做完試驗，及時用適當溶劑沖洗柱子和進樣閥，尤其是對過夜的柱子和進樣閥，一定要用足量的水徹底洗凈其中的鹽類、緩沖液，再用甲醇或乙腈沖洗，并保存在乙腈(或甲醇)中。正相柱保存在非極性有機溶劑(如己烷)中。含鹽流動相的沖洗方法：每天操作結束后，先用純化水或含甲醇5%的水沖洗時間約20～30分鐘，再用純甲醇沖洗約30～60分鐘(注：不能直接用有機溶液沖洗，鹽類易析出，堵塞色譜柱，造成色譜柱永久性損壞;所用水最好是重蒸餾的水，必須抽濾和脫氣)。不含鹽的流動相沖洗方法：每天操作結束后，先用流動相沖洗約10～15分鐘，再用含5%甲醇的水沖洗10～20分鐘，最后用純甲醇沖洗，時間約20～30分鐘(注：不能直接用純水沖洗，易造成流動停止)。
10. 以硅膠為基質(zhì)的柱子，如C-18、C-8等，要控制好流動相的pH值，一般不要低于2.5，不高于7.0。pH>8會使硅膠骨架溶解;pH<2則鍵合相化學鍵易剝離。
11. 盡量用流動相溶解樣品，一是避免出現(xiàn)拖尾峰、怪峰，二是避免試樣在系統(tǒng)中由于溶解度降低而析出。
12. 用HPLC分析酸堿性物質(zhì)，由于吸附作用(次級保留)使峰形拖尾。加入改良劑可以大大改善峰形，提高積分的準確度。一般規(guī)則是：①分析酸性物質(zhì)，可加入1%有醋酸;②分析堿性物質(zhì)，可加入10-20mmol/L三乙胺;③酸堿物質(zhì)混為一體，可同時加入1%的醋酸和10-20mmol/L三乙胺。
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